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毛發檢測新型毒品的研究進展

所謂新型毒品主要是相對鴉片、海洛因、大麻等傳統麻醉藥品而言,由人工化學合成的致幻劑、興奮劑類毒品。是由國際公約及我國法律法規所規定管制的直接作用于人的中樞神經系統,具有較強興奮或抑制作用,連續使用能使人產生依賴性的一類化學毒品。

與傳統的鴉片類毒品相比,新型毒品主要通過化學合成,因為其濫用多發生在娛樂場所,所以又被稱為俱樂部毒品、休閑毒品、假日毒品。


新型毒品主要通過化學合成,其成分、含量、外觀不同,名字也五花八門。但根據新型毒品的毒理性質和主要成分,大致可以將其分為4類:第一類以中樞興奮作用為主,主要指苯丙胺類(Amphetamine-type Stimulants,ATS)興奮劑,即結構中含有苯丙胺結構的化合物,代表物質是甲基苯丙胺(Methamphetamine,MA,在我國俗稱冰毒”) ;第二類是致幻劑,代表物質是氯胺酮(
Ketamine
,KET,俗稱“K”);第三類兼具興奮和致幻作用,代表物質是3,4-亞甲二氧基甲基苯丙胺(3,4-ethylenedioxymethanphetamine,MDMA,搖頭丸的主要成分) ,屬于苯丙胺的衍生物; 第四類是一些以中樞抑制作用為主的物質,包括氟硝西泮(Flunitrazepam,FLU)γ-羥基丁酸(Gamma Hydroxybutyrate,GHB) ,以上代表物質化學結構如左下所示。


據統計,我國吸食新型毒品的人數每年增長30%左右,其中青少年占了86%。新型毒品的濫用造成了嚴重的個體危害和社會危害,為了有效打擊新型毒品犯罪,緊密配合公安等執法部門的禁毒需要,分析工作者們建立了一系列準確、快速、高靈敏的定性定量分析檢測新型毒品的方法。而毛發作為毒品的一個特殊載體,具有其他檢材不可比擬的優勢,取材容易,攜帶方便,易長期保存且毒品在毛發中代謝較慢可長期存在,因此毛發中毒品的分析已成為法庭科學和臨床分析的研究熱點,發揮著越來越重要的作用。


1 毛發的前處理技術

毛發中的毒品主要位于毛發的角質層和髓質層內,和蛋白質結合在一起,因此在檢驗毛發中的毒品之前需要對毛發樣品進行前處理,將毒品從毛發中釋放出來,同時也要消除毛發外部的油脂、汗液以及各種污染物。對前處理技術方法的選擇,在具體操作過程中,應參照目標藥物的性質與分析目標,采用適合的處理方法。應同時考慮以下幾種情況:1)所有被分析物的種類及其代謝物在處理過程中是否破壞其穩定性;2)分析物的回收率;3)定性和定量過程所采用的分析方法;4)是否能夠達到分析目的。本文首先對查閱文獻的前處理技術和分析方法進行了歸納,詳見表1。


去除毛發的污染,均可采用二氯甲烷或水-丙酮沖洗或超聲振蕩,這也是毛發最常見的清洗方法,有文獻報道兩者清洗效果無明顯差別,二氯甲烷試劑單一,步驟簡單,但揮發時間較丙酮長。分析ATS、MDMA時,也有報道采用0.1%SDS(十二烷基磺酸鈉)-水清洗,少數報道采用其他方法清洗,如甲醇、異丙醇、吐溫以及洗潔精等,另外清洗的次數不宜太多,一般為23次,過多次數的清洗也會降低毛發中樣品的濃度。


目前,釋放毛發中新型毒品的水解方法主要有堿水解、酸水解、甲醇水解、酶水解和醇酸混合水解。堿水解的主要方法是將毛發在1mol/LNaOH50100加熱1530分鐘。堿水解可使毛發溶解,固化在角蛋白中的毒品及代謝物藥物釋放完全,因此對于堿性條件下比較穩定的化合物,堿水解成為首選方法。有關毛發中苯丙胺類毒品分析的報道中50%以上采用NaOH水解,而采用其他水解方法的報道多因同時分析KET、去甲基氯胺酮(NOR,KET 的主要代謝物) 以及嗎啡(MOR) 等其他堿性條件下不穩定的物質。何洪源等也曾系統考查了毛發的多種水解(及提取) ,包括堿水解、酸水解及有機溶劑超聲提取等方法,然后用相同的方法萃取、檢測,通過毒品與內標的峰面積比來比較不同方法的水解效果。最后確定了毛發中苯丙胺類毒品的最佳水解方法是堿水解。分析GHB時,所查閱的文獻均報道采用NaOH水解,但方法是將毛發在0.01mol/LNaOH中隔夜孵化。Goulle曾對各種水解方法進行了比較:1mol/L
NaOH95
加熱15分鐘,0.10.01mol/L NaOH、0.10.05mol/LH2SO4、0.6mol/LHCI、0.5mol/LNH4Cl,水、磷酸緩沖液56孵化16小時以及甲醇超聲4小時,結果顯示堿水解的回收率明顯提高,尤其是1mol/L NaOH水解的回收率高達98%,但因1mol/L NaOH 水解時雜質干擾較多,且GHB屬極性物質,若在接下來的提取步驟中采用分子量較小的三甲基硅烷(TMS)衍生化時,采用0.01mol/L NaOH水解是最佳的選擇,若改用分子量較大的叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS) 衍生化,能消除干擾,則可采用1mol/L NaOH加熱水解。


酸水解通常是將發毛在0.1mol/L的鹽酸中60以下孵化數小時到一整夜,酸水解條件較為溫和,在堿性條件下不穩定的物質可采用此法,如K 粉以及代謝物。甲醇水解主要方法是超聲振蕩,甲醇水解因藥物釋放不完全且提取物雜質較多,因此單純采用甲醇水解的報道較少。酶水解是將毛發置于酶(如蛋白酶K)中低溫水浴加熱,該法在中性PH下進行,不穩定的藥物降解少。對酸堿適用范圍廣、快速、徹底、專屬性強,但成本相對較高。對酸堿敏感的FLU可采用酶水解或甲醇水解。


醇酸混合水解,即甲醇與鹽酸或三氟乙酸按不同體積比混合后超聲振蕩或隔夜孵化進行水解。Kim5種水解方法(結合提取方法)
的水解效率進行了比較研究,結果顯示:水解效率從高到低依次為0. 25mol/L 甲醇化的HCl50超聲>5mol/L HCl/甲醇(V/V=120)50超聲>1mol/L NaOH95加熱10分鐘>1mol/LHCl 50隔夜孵化>甲醇超聲1小時。Wu也對各種水解條件進行了研究,得出分析苯丙胺類毒品,NaOH水解回收率最高,但當同時需分析堿性條件下不穩定的其他毒品及其代謝物時,甲醇/三氟乙酸(8.51.
5)
的混合液隔夜孵化是最佳選擇以上方法為毛發水解的主要方法,除此之外,還有個別報道采用緩沖溶液進行水解的。


毛發中新型毒品及其代謝物的提取方法有液-液萃取(Liquid-liquid extraction,LLE) 、固相萃取(Solid-phase extraction,SPE)、固相微萃取(Solid-phase micro-extraction SPME)、液相微萃取(Liquid-phase micro-extraction,LPME)、微型研磨提取(Micropulverized extraction,MPE)等方法。LLE是最傳統的毒品提取方法,毛發水解后,調PH到適當值,加入乙酸乙酯或環己烷、正己烷、乙醚等有機溶劑,漩渦振蕩、離心,取有機相,在50左右氮氣流下吹干,再加有機溶劑溶解或衍生化后分析測試。該方法設備簡單,操作簡便,適于各種毒品的提取分離,成本低,易推廣。但它帶入的雜質較多,需進一步凈化,且繁瑣費時,難以實現自動化。目前,分析毛發中的新型毒品中有60%以上的分析報道采用LLE提取法。SPE利用物質在溶劑與吸附劑(固定相)間選擇性吸附與洗脫操作,達到分離凈化和富集目的。具有選擇性強,簡單、快速、取樣量小,節省溶劑等優點,可用于大體積樣品中微量組分的富集,也是提取毛發中毒品的有效手段。


SPME集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體,其選擇性好、靈敏度高,便于攜帶,操作時間短,樣品用量小,無需萃取溶劑,能實現樣品的現場采集和富集,可直接與氣相色譜儀或液相色譜儀聯用,尤其是頂空固相微萃取技術(HS-SPME),操作簡單、快速,可有效避免不揮發性物質的干擾,在法醫學領域已表現出強大的優勢。Gentili采用HSSPME分析毛發中的ATS,將毛發、內標物和30%NaOH
置于小玻璃瓶內,快速密封后70加熱20分鐘,吸取頂空物質采用氣相色譜二級質譜法分析,獲得了滿意的效果,檢出限在1ng/mg以下,回收率在90%以上,水解與提取可在同一裝置內進行,且無需衍生化。LPME的萃取模型包括靜態液相微萃取和動態液相微萃取。具有有機溶劑用量小,污染少;集目標物的萃取、純化、濃縮于一步,操作簡單,勞動強度小; 無需特殊設備,成本低等特點,近年來,作為一種新型的樣品前處理技術,已經引起了環境分析領域的許多研究人員的注意,但在毒品分析領域僅有少數報道,孟品佳采用動態LPME-微波衍生化的方法提取發毛中的ATSMDMA等物質,毛發經NaOH水解后,直接加入小體積50μL氯仿進行渦旋提取1分鐘,離心1分鐘,不經過氮氣吹干過程,直接吸取下層氯仿溶液20μL在微波加熱的條件下進行衍生化反應后測試。該方法把消解、提取、衍生化和檢測等過程環環相扣地結合在一起,無需調節pH、揮發溶劑等過程,簡化了操作過程,減少了損失,而且方法的靈敏度高、重復性好、成本低,適合于毛發中微量苯丙胺類毒品的檢測。


近年來,Hajime等發展了微型研磨萃取法(Micropulverized extraction,MPE),利用微型研磨機對水介質中的毛發進行研磨,使之變成微米尺寸的粉末,增大其表面積,有利于藥物的釋放,且經研磨后的毛發角質層被破壞,有利于溶劑滲入到毛發內部,提取毛發皮質層和髓質層內的毒品。其具體做法是:將1mg 洗凈的毛發置于2mL的塑料試管中,加入不銹鋼的研磨子彈和100μL10mmol/L的磷酸鹽緩沖液,蓋上蓋子,運用自動粉碎機垂直振搖5分鐘(1500/每分鐘),離心后用鑷子取出研磨子彈,再用0.45μm微孔的聚偏二氟乙烯薄膜過濾后用于液相色譜分析。該作者用此方法提取毛發中的AP(苯丙胺)MA,回收率可達96.4%-108.2%,與傳統的消解提取過程相比,樣品用量少,僅需1mg;樣品處理僅需在一個獨立的實驗臺上即可進行,集水解和提取于一體,且無需溶劑的揮發過程,避免了各種污染;若采用液相色譜分析,整個處理和分析過程( 不包括清洗) 不超過30分鐘。該作者還將該提取方法分別結合GC/MS和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)分析毛發中的MA,當采用MPEELISA測定時,樣品分析與處理過程簡單、快速,無需溶劑揮發,無需提供氮氣、大功率與真空設備,所需設備簡單、可攜帶,因此可實現樣品的現場分析。但該方法目前主要應用于提取毛發中的MA,提取其他毒品的應用尚在研究之中。Kim也報道了MPE法提取毛發中的AP、MA、MDMA等物質,但操作方法不同,該作者取10mg毛發利用玻珠研磨機研磨1.5分鐘,在1ML甲醇中50超聲孵化1小時,揮干溶劑,用HFBA50衍生化30分鐘,進氣相色譜分析,每一種物質的檢出限均可達0.028ng/mg,回收率8.9%-101.2%,方法簡單、快速。


毛發中毒品或代謝物含量甚微,一般為ng/mg水平,且測試時需經過提取、凈化等前處理過程,需采用靈敏度較高、準確性好的儀器分析法,常見的有氣/質聯用(GC/MS)法、氣/質聯用串聯質譜法(GC/MS/MS)、高效液相色譜(HPLC)法、液質聯用串聯質譜法(LC
/MS/MS)
法等方法,也有個別報道采用毛細管區帶電泳法(CZE)。GC/MS 是分析毛發中毒品的主要方法,有近50%的文獻報道采用GC
/MS
。但對于新型毒品來說,因結構中多含有胺基或羥基等極性基團,采用GC/MS分析時一般需要對樣品進行衍生化,以改善樣品的氣相色譜性質或質譜行為,提高檢測毒品靈敏度,苯丙胺類及其衍生物主要采用?;瘜坊D化為酰胺,常用的衍生化試劑主要有三氟乙酸酐(TFAA)、三氟乙酰氯(TFAP)、七氟丁酸酐(HFBA)、N-甲基-雙三氟乙酰胺(MBTFA)等;而對于含有羥基的GHB毒品,則需進行硅烷化以取代結構中的活性氫,降低氫鍵的束縛,提高被檢測能力,文獻采用的硅烷化試劑為N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(
BSTFA)+
三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS)。


HPLC法也能將目標藥物從干擾基質中分離,且不受分析物揮發性、極性、熱穩定性的限制,流動相可選擇范圍寬,可以分離各種分子量范圍的物質,近幾年來多篇文獻報道采用HPLC法分析毛發中的新型毒品,對于沸點比較高的KETFLU,查閱到的文獻均采用HPLC法分析。串聯質譜法即質譜-質譜(MS/MS) 聯用技術,是一種新興的分析技術,它由二級以上的質譜儀串聯而成,是融分離和鑒定為一體的分析方法,與單級質譜相比,能明顯改善信號的信噪比,具有更高的靈敏度和選擇性,其檢測水平可以達到pg級,能檢測出吸食者吸食一次計量的毒品,非常適合于痕量組分的分離和鑒定,因此,在毛發中的毒品分析方面顯示了極大的優越性,目前,MS/MS多與GCLC聯用,形成GC-MS/MSLC-MS/MS分析方法,成為毛發中毒品分析方法的一個新趨勢,所查閱的2010年之后的文獻中近60%采用串聯質譜法,而FLUKET的報道均采用LC-MS/MS分析法。


隨著新型毒品濫用程度的嚴重化,對新型毒品的分析檢測在法庭科學領域也變得越來越重要。而毛發作為毒品的一個特殊載體,具有取材方便,容易保存,不受污染等特點,且可提供長期、可靠、全面的毒品使用信息,因此毛發檢材的使用越來越受到法庭科學工作者的重視。人們在不斷探索建立快速、簡單、有效的前處理方法和準確、快速、靈敏的分析方法。隨著儀器設備性能不斷改善,分離技術不斷提高,毛發檢材中新型毒品及其代謝物的檢測方法也逐步向成熟化、標準化、自動化、快速化、靈敏化、現場化發展,但值得一提的是,分析時應注意將水解方法、提取方法等前處理技術與分析方法相互結合,達到最優化的分析檢測程序,而不應將各程序彼此孤立。

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